1. 準備するもの
(1) 検体
- サンプル:培養上清を精製したDNA
- 陰性対照:PCR mixtureに用いた精製水
- 陽性対照1:マイコプラズマ汚染細胞の培養上清を精製したDNA
- 陽性対照2:マイコプラズマゲノムDNA
(2)機器
- PCR Thermal Cycler(Applied Biosystems® GeneAmp® PCR System 9700, Ramp speed: Max mode)
(Applied Biosystems® Veriti® Thermal Cycler)
(3)PCRプライマー
PCR プライマー (4種類)
1st step forward primer
AF5 5’-CTAACTAACACTTAGCACAA-3’
1st step reverse primer
AR6 5’-ACTGTGTGCCCTTTGTTCCT-3’
2nd step forward primer
AF3 5’-GTCACTCAAACAAGTAACCA-3’
2nd step reverse primer
AR5 5’-TTTCAAAGATCTCAATTAGG-3’
2.方法
(1)1st-step PCR
【1st step PCR mixture】
DDW | 12.9 μl |
10×AmpliTaq Gold® 360 Buffer | 2.0 μl |
10×dNTP Mixture (2.5 mM each) | 1.6 μl |
25 mM MgCl2 | 1.6 μl |
10μM (10 pmol/μl) AF5 | 0.4 μl |
10μM (10 pmol/μl) AR6 | 0.4 μl |
AmpliTaq Gold® 360 DNA Polymerase | 0.1 μl |
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Total | 19.0 μl / sample |
1) 1の(1)で準備した検体(DNA精製サンプル、陰性・陽性対照)を1μlずつ加える。
2) PCR program
Stage1 : 95℃ 10分(1サイクル)
Stage2 : 95℃ 30秒 → 55℃ 30秒 → 72℃ 30秒(30サイクル)
Stage3 : 72℃ 5分(1サイクル)
Stage4 : 4℃ (保存)
(2)2nd-step PCR
【2st step PCR mixture】
DDW | 12.9 μl |
10×AmpliTaq Gold® 360 Buffer | 2.0 μl |
10×dNTP Mixture (2.5 mM each) | 1.6 μl |
25 mM MgCl2 | 1.6 μl |
10μM (10 pmol/μl) AF3 | 0.4 μl |
10μM (10 pmol/μl) AR5 | 0.4 μl |
AmpliTaq Gold® 360 DNA Polymerase | 0.1 μl |
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Total | 19.0 μl / sample |
1) 1st-step PCR産物を1μlずつ加える。
2)(1)2)と同じプログラムを実行する。
3.判定
陰性対照にバンドがないこと、陽性対照(培養上清)、陽性対照(ゲノムDNA)において、250bp位のPCR産物のバンドがあることを確認後、検体の判定をする。
陰性:バンドがない
陽性:250bp位のPCR産物のバンドがある