Nested-PCRによるA. laidlawii検出方法

(最終更新日:2016年9月1日)

1. 準備するもの

(1) 検体

  • サンプル:培養上清を精製したDNA
  • 陰性対照:PCR mixtureに用いた精製水
  • 陽性対照1:マイコプラズマ汚染細胞の培養上清を精製したDNA
  • 陽性対照2:マイコプラズマゲノムDNA

(2)機器

  • PCR Thermal Cycler(Applied Biosystems® GeneAmp® PCR System 9700, Ramp speed: Max mode)
    (Applied Biosystems® Veriti® Thermal Cycler)

(3)PCRプライマー
PCR プライマー (4種類)
 1st step forward primer
   AF5   5’-CTAACTAACACTTAGCACAA-3’
 1st step reverse primer
   AR6   5’-ACTGTGTGCCCTTTGTTCCT-3’
 2nd step forward primer
   AF3   5’-GTCACTCAAACAAGTAACCA-3’
 2nd step reverse primer
   AR5   5’-TTTCAAAGATCTCAATTAGG-3’

2.方法
(1)1st-step PCR
【1st step PCR mixture】

DDW 12.9 μl
10×AmpliTaq Gold® 360 Buffer 2.0 μl
10×dNTP Mixture (2.5 mM each) 1.6 μl
25 mM MgCl2 1.6 μl
10μM (10 pmol/μl) AF5 0.4 μl
10μM (10 pmol/μl) AR6 0.4 μl
AmpliTaq Gold® 360 DNA Polymerase 0.1 μl

Total 19.0 μl / sample

1) 1の(1)で準備した検体(DNA精製サンプル、陰性・陽性対照)を1μlずつ加える。
2) PCR program
  Stage1 : 95℃ 10分(1サイクル)
  Stage2 : 95℃ 30秒 → 55℃ 30秒 → 72℃ 30秒(30サイクル)
  Stage3 : 72℃ 5分(1サイクル)
  Stage4 : 4℃ (保存)

(2)2nd-step PCR
【2st step PCR mixture】

DDW 12.9 μl
10×AmpliTaq Gold® 360 Buffer 2.0 μl
10×dNTP Mixture (2.5 mM each) 1.6 μl
25 mM MgCl2 1.6 μl
10μM (10 pmol/μl) AF3 0.4 μl
10μM (10 pmol/μl) AR5 0.4 μl
AmpliTaq Gold® 360 DNA Polymerase 0.1 μl

Total 19.0 μl / sample

 1) 1st-step PCR産物を1μlずつ加える。
 2)(1)2)と同じプログラムを実行する。

(3)電気泳動(2%アガロースゲルを使用)

3.判定
 陰性対照にバンドがないこと、陽性対照(培養上清)、陽性対照(ゲノムDNA)において、250bp位のPCR産物のバンドがあることを確認後、検体の判定をする。
 陰性:バンドがない
 陽性:250bp位のPCR産物のバンドがある



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