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マイコプラズマ検査

マイコプラズマは微小な生物であるため、肉眼で観察することは出来ず、培養細胞や培養液を汚染していても気付かないことがほとんどです。しかしながら、マイコプラズマの汚染によって、細胞内のほとんどすべての代謝反応、細胞の特性や増殖にまで影響を及ぼすとされています。気付かないうちにマイコプラズマ汚染が細胞培養環境に広がっている可能性もあり、日常的にマイコプラズマ検査を行うことが望まれます。

マイコプラズマ検出法には数多くの方法が開発されていますが、当室では、蛍光色素による検出方法とNested-PCRにる検出方法を併用して、総合的に判定を行っています。

・マイコプラズマ検査の前に・・・
抗生物質が含まれているサンプルではマイコプラズマが検出されづらく、より正確に高感度にマイコプラズマの汚染を検出するために、抗生物質を含まない培地で3週間以上培養することが必要です。

蛍光色素による検出方法　※ 参考文献 (1)～(4)

マイコプラズマの核DNAを蛍光色素（Hoechst 33258）で染色し蛍光顕微鏡で直接観察を行うことで、培養細胞のマイコプラズマの汚染を検出します。指標細胞としてVero細胞を用いてサンプルを共培養し、生存しているマイコプラズマの増殖を促すことで、高感度で検出することが可能です。マイコプラズマを増殖させる必要があるため、判定までに5－6日ほど期間が必要であり、また、サンプルおよび指標細胞の死細胞に由来する核断片等も染色されるため、判定には経験を要します。
※研究用ヒト臍帯血材料（HCB , CBF , C34）と研究用ヒト間葉系幹細胞（HMS）は検査を行っておりません。

マイコプラズマに汚染されたVero細胞の蛍光染色画像
マイコプラズマに汚染されたVero細胞の蛍光染色画像
（蛍光色素：Hoechst 33258、対象：核DNA）

Nested-PCRによるマイコプラズマ検出方法 ※参考文献 (5)～(8)
マイコプラズマは多くの種類が存在し、下図の様に種によって16S-23S rRNAのスペーサー領域に多型を示します。この多型を挟む共通配列を標的としたprimerを用いて、Nested-PCR法により検出を行うため、マイコプラズマの有無の他、増幅サイズからある程度の種を予測する事もできます。微量のマイコプラズマによる汚染を短時間で簡便に検出・判定できますが、すべての種類のマイコプラズマを検出できるわけではないという問題点もあります。

nested-pcr

検出を確認したコントロールDNAと増幅サイズ

このPCRで検出可能な100数十種類のマイコプラズマ および 近縁種のうち、当室で実際に検出を確認している種は12種類。
（* 　 は培養細胞に感染例の多いマイコプラズマ種)

Species Main host Strains Source [Cat #] 1st-step PCR product (bp) 2nd-step PCR product (bp)
Mycoplasmopsis arginini Bovine NCTC10129 Minerva Biolabs [51-0129] 370 236
Mesomycoplasma hyorhinis Porcine NCTC10130 Minerva Biolabs [51-0130] 448 314
Mycoplasmopsis fermentans Human NCTC10117 Minerva Biolabs [51-0117] 492 366
Metamycoplasma orale Human NCTC10112 Minerva Biolabs [51-0112] 424 290
Metamycoplasma hominis Human ATCC 23114 Minerva Biolabs [51-0111] 370 236
Mycoplasmoides genitalium Human ATCC 33530 Minerva Biolabs [51-0195] 390 252
Metamycoplasma salivarium Human NCTC10113 Minerva Biolabs [51-0113] 403 269
Mycoplasmoides pirum Human ATCC 25960 ATCC [25960 D] 459 323
Mycoplasmoides pneumoniae Human NCTC10119 Minerva Biolabs [51-0119] 416 280
Mycoplasmopsis synoviae Avian NCTC10124 Minerva Biolabs [51-0124] 496 362
Mycoplasmoides gallisepticum Avian NCTC10115 Minerva Biolabs [51-0115] 846 710
Spiroplasma citri Insect, Plant ATCC 27556 Minerva Biolabs [51-0164] 462 326

コントロールDNAの検出感度（バンド検出回数 / PCR検査回数）

myco_control

Nested-PCRによるA. laidlawii 検出方法　※参考文献 (9)

培養細胞に感染例の多いAcholeplasma属の一種「Acholeplasma laidlawii」に特異的なPrimerを用い、16S-23S rRNAのスペーサー領域をNested-PCR法によって検出します。
achole_pcr

検出を確認したコントロールDNAと増幅サイズ

Species Main host Strains Source [Cat #] 1st-step PCR product (bp) 2nd-step PCR product (bp)
Acholeplasma laidlawii Bovine NCTC10116 Minerva Biolabs [51-0116] 392 249

コントロールDNAの検出感度（バンド検出回数 / PCR検査回数）
achole_control

陽性コントロールDNA検出イメージ
添加された鋳型量によって、1st-stepと2nd-step 両方のバンドが現れる場合があります。
ladder.png

<参考文献>

  1. IFO Res. Comm., 13, 52-58 (1987)
  2. Bull. Jap. Fed. Culture Collections, 4, 9-15 (1988)
  3. 日本組織培養学会細胞バンク委員会報告書（平成2年3月）
  4. 日本薬局方　バイオテクノロジー応用医薬品/生物期限由来医薬品の製造に用いる細胞基材に対するマイコプラズマ否定試験（第17改訂　参考情報　平成28年3月）
  5. Res. Microbiol., 144, 489-493 (1993)
  6. Rapid Diagnosis of Mycoplasmas,227-232[eds.I.Kahane&A.Adoni](1993)
  7. 蛋白質核酸酵素40(15):2361-2368(1995)
  8. Mol & Diag. Proced. in　Mycoplasmology,vol.ⅡA7[eds.Razin&Tully](1996)
  9. 日本工業規格JIS K 3810-3:2003


 

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