1. 準備するもの
(1) 検体
・サンプル：培養上清を精製したDNA
・陰性対照：PCR mixtureに用いた精製水
・陽性対照1：マイコプラズマ汚染細胞の培養上清を精製したDNA
・陽性対照2：マイコプラズマゲノムDNA
(2)機器
・PCR Thermal Cycler
(Applied Biosystems® GeneAmp® PCR System 9700, Ramp speed: Max mode)
(Applied Biosystems® Veriti® Thermal Cycler)
(3)PCRプライマー
PCR プライマー （4種類）
1st step forward primer
1st step reverse primer
2nd step forward primer
2nd step reverse primer
※()書きはMix塩基として合成する。
2.方法
(1)1st-step PCR
【1st step PCR mixture】
| DDW | 12.9 μL |
| 10×AmpliTaq Gold® 360 Buffer | 2.0 μL |
| 10×dNTP Mixture (2.5 mM each) | 1.6 μL |
| 25 mM MgCl2 | 1.6 μL |
| 10μM (10 pmol/μL) MCGpF11 | 0.4 μL |
| 10μM (10 pmol/μL) MCGpR1 | 0.4 μL |
| AmpliTaq Gold® 360 DNA Polymerase | 0.1 μL |
|
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| Total | 19.0 μL / sample |
1) 1の(1)で準備した検体（DNA精製サンプル、陰性・陽性対照）を1μLずつ加える。
2) PCR program
Stage1 : 95℃ 10分（1サイクル）
Stage2 : 95℃ 30秒 → 55℃ 2分 → 72℃ 2分（30サイクル）
Stage3 : 72℃ 5分（1サイクル）
Stage4 : 4℃ （保存）
(2)2nd-step PCR
【2st step PCR mixture】
| DDW | 12.9 μL |
| 10×AmpliTaq Gold® 360 Buffer | 2.0 μL |
| 10×dNTP Mixture (2.5 mM each) | 1.6 μL |
| 25 mM MgCl2 | 1.6 μL |
| 10μM (10 pmol/μL) R16-2 | 0.4 μL |
| 10μM (10 pmol/μL) MCGpR21 | 0.4 μL |
| AmpliTaq Gold® 360 DNA Polymerase | 0.1 μL |
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|
|
| Total | 19.0 μL / sample |
1) 1st-step PCR産物を1μLずつ加える。
2)(1)2)と同じプログラムを実行する。
(3)電気泳動（2%アガロースゲルを使用）
3.判定
陰性対照にバンドがないこと、陽性対照（培養上清）、陽性対照（ゲノムDNA）において、200～750 bpのPCR産物のバンドがあることを確認後、検体の判定をする。
陰性：バンドがない
陽性：200～750 bpのPCR産物のバンドがある
