細胞材料開発室　-CELL BANK-

※日本組織培養学会の標準プロトコ－ルに準じて一部改変

1. 準備するもの

・検体

調整法　：

抗生物質を含まない培地で3週間以上培養した細胞を準備し、継代後または培地交換後3日以上経過した培養上清を採取する

・Vero細胞　（マイコプラズマに感染していないことが確認済のもの）
　　　　細胞濃度　：　1-2 x 10⁴ cells / 35dish (0.5ml)
　　　　必要なdish数　：　検体の数　＋　Negative control用 2枚

・Vero細胞用培地

・染色原液 （-20℃ 保存）
　室温で30-40分間、スターラーを使ってよく攪拌し、1回に使う必要量を分注し、アルミホイルで完全に包み遮光する

・Mounting solution（PH 5.5に調整、4℃ 保存）

・固定液

・ PBS(－)希釈固定液

・蒸留水
・35mm dish
・カバーガラス　22 x 22 （mm）　（乾燥滅菌済み）
・ピンセット
・スライドガラス
・蛍光顕微鏡

2. 方法　((1) – (6) の操作は無菌操作を行う。　(7) – (17) の操作は無菌操作は不要。)

(1)	乾熱滅菌した22 x 22 （mm）カバーガラスを更に火炎滅菌し、35mm dishに入れる （図1）	図１-a. カバーガラスをディッシュに入れる → (1)
(2)	Vero細胞用培地を (1) のdishに1ml/dish分注する 注）この時にカバーグラスとdish底面との間に気泡が入らないようにする
(3)	1-2 x 104 cells / 35mm dish / 0.5ml　のVero細胞を均一になるように (2) のdishに播種する
(4)	Negative control として、検体を加えないVero細胞を (3) と同様に (2) のdishに播種し、 検体と同量のVero細胞用培地 (1ml/dish) 添加し、インキュベーター内（37℃、5%CO2）に静置する。
(5)	(3) のVero細胞を一晩培養した後、検体を1ml/dish添加する
(6)	検体の添加後5、6日間、インキュベーター内（37℃、5%CO2）に静置する。	図１-b. カバーガラスが入ったディッシュ → (1)
(7)	染色原液をPBS(－)で100倍に希釈し、アルミホイルで包んで30分間スターラーで攪拌する
(8)	Negative control のVero細胞および検体を添加したVero細胞のdishから培地を除去する
(9)	2ml PBS(－)で洗浄し、上清を除去する（2～3回繰り返す）
(10)	PBS(－)希釈固定液を2ml加え、15分間固定した後、 PBS(－)希釈固定液を除去する
(11)	固定液を2ml加え、5分間固定し、固定液を除去する	図2. カバーガラスをディッシュの縁に立たせて乾燥させる → (14)
(12)	2ml PBS(－)で洗浄し、上清を除去する（3回繰り返す）
(13)	(7) の100倍希釈した染色原液を2ml加え、10分間静置する
(14)	蒸留水で2回洗浄し、カバーガラスを割らないようにピンセットでそっと外し、細胞面を上にして乾燥させる （図2）
(15)	スライドガラスにMounting solutionを1滴ずつ滴下する
(16)	染色後、乾燥したカバーガラスを細胞が付着した面が下になるように、Mounting solutionの上に被せる
(17)	蛍光顕微鏡（Hoechst 33258の励起光）で蛍光観察（接眼レンズ x10、対物レンズ x40）を行う （接眼レンズ x10、対物レンズ x100（油浸）による観察が望ましい）

3. 判定
　培養細胞に対して、維持培養中に2回以上の検査を行う。

・陰性（－）	：　Vero細胞の核以外の蛍光斑点が確認されない場合
・陽性（＋）	：　マイコプラズマと思われるフィラメント状の微小な蛍光斑点や球状粒子の微小な核外蛍光斑点が、細胞質内および細胞間隙に確認された場合

判定(－)
判定(＋)：フィラメント状 (Mycoplasma fermentans)	判定(＋)：球状粒子 (Mycoplasma arginini)

※ 当室で同定された培養細胞に感染するマイコプラズマの感染画像例 （宿主細胞は全てVero細胞）

• Mycoplasma orale
• Mycoplasma hyorhinis
• Mycoplasma arginini
• Mycoplasma fermentans
• Acholeplasma laidlawii