HTLV-1検査

レトロウイルスの一種であるHTLV-1(Human T-cell leukemia virus type 1;ヒトT細胞白血病ウイルス1型)は、成人T細胞白血病(adult T-cell leukemia, ATL)の原因ウイルスとして知られています。 HTLV-1のX遺伝子を標的としたprimerを用いて、培養細胞ゲノムにインテグレートされたHTLV-1プロウイルスを PCRによって検出する方法により、細胞材料がHTLV-1に汚染されているかどうかの検査を行っております。
検査対象となる細胞材料は、ヒト血液系由来細胞株およびヒトリンパ球系細胞株です。

1.準備するもの
(1) 検体

抽出したゲノムDNA溶液: 30ng/µl以上
抽出方法: およそ6cm dish 1枚分(2×106個程度)の細胞を回収し、PBS(-)で洗浄した細胞ペレットからDNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN Cat#69506 ) を用いてゲノムDNAを抽出する。
溶出には抽出キットに添付されているバッファー 200µlを用いる。

(2) 機器とPCRチューブ

  • 0.2ml PCR tube
  • トレー / リテーナー (PCR容器に適合するもの)
  • サーマルサイクラー
  • アガロースゲル電気泳動装置
  • ゲルトレイ、コーム
  • トランスイルミネーター

(3) PCRプライマー
  ・ PCRプライマー (参考文献 : S.Kwok et al., Blood, 72(4), 1117-1123, 1988)

HTLV-1 X forward 5’-CGGATACCCAGTCTACGTGT-3’

HTLV-1 X reverse 5’-GAGCCGATAACGCGTCCATCG-3’

  ・ 内部コントロールプライマー

β-globin forward 5’-GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG-3’

β-globin reverse 5’-TGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG-3’

(4) 試薬

  • Ex Taq Hot Start Version ( TaKaRa Cat#RR006A 250unit ) Buffer、dNTP 添付
  • 2% アガロースゲル
  • サイズマーカー(100bp DNA Ladder)
  • 10 x Loading Buffer
  • 10 mg/ml EtBr Solution
  • DDW
  • 陽性対照 : 過去の検査で陽性だったゲノムDNA
  • 陰性対照 : 過去の検査で陰性だったゲノムDNA
  • 50 x TAE
    Trizma base 242g
    glatinal acetic acid 57.1ml
    0.5m EDTA ( pH 8.0 ) 100ml
    Milli-Q水 842.9ml

    / 1L
  • 1 x TAE
    50 x TAE 20ml
    Milli-Q水 980ml

    / 1L
  • 1µg/ml エチジウムブロマイド溶液
    10 mg/ml EtBr solution 10µl
    1 x TAE 100ml

2.方法
※ ゲノム抽出が済んでいない検体は、予めゲノムの抽出を行う。抽出後の濃度測定で30μg/μl以上であったゲノムDNAはDDWで10倍希釈して用いる。

(1) ゲノムDNA(テンプレートDNA)をミキサーで十分に撹拌する。
(2) PCR mixture を調整し、それぞれの検体をPCRチューブに分注する。
  調整する量は検体数+2(ポジティブコントロールx1、ネガティブコントロールx1)分の検体分を用意する。

PCR misture の組成 1検体あたりの液量
テンプレートDNA 5.0µl
PCRプライマー HTLV-I X FW (10pmol/µl) 0.5µl
PCRプライマー HTLV-I X RV (10pmol/µl) 0.5µl
内部コントロールプライマー β-globin FW (10pmol/ml) 0.5µl
内部コントロールプライマー β-globin RV (10pmol/ml) 0.5µl
10 x Ex Taq Buffer 2.5µl
2.5mM each dNTP mix 2.0µl
DDW 13.25µl
Ex Taq Hot Start Version 0.25µl

総量 25.0µl

(3) 各検体の入ったPCRチューブをトレー / リテーナーとともにサーマルサイクラーにセットする。
(4) サーマルサイクラーに下記の設定を入力し、反応させる。
   Stage 1 : 94℃ 5分    (1サイクル)
   Stage 2 : 94℃ 10秒 → 60℃ 1秒 → 72℃ 15秒 (40サイクル)
   Stage 3 : 72℃ 5分 (1サイクル)
   Stage 4 : 4℃ (保存)
(5) PCR増幅検体 10 µl に 10 x Loading Buffer を1 µl 加える。 
(6) 2%アガロースゲルを作製し、電気泳動を行う。
(7) 泳動後のアガロースゲルを1 µg/ml エチジウムブロマイド溶液で染色を行う。
(8) トランスイルミネーターによりDNAのバンドを確認する。

泳動結果例

3.判定
陰性対照に160bpのバンドがないこと、陽性対照に160bpのPCR産物のバンドがあることを確認後、検体の判定を行う。(β-globinの262bpのバンドを確認し、PCR阻害がなかったことを確認)
   陰性 : バンドがない
   陽性 : 160bpのPCR産物のバンドがある

 ※ 陽性の判定または他のバンドが検出された場合、偽陽性の可能性も考慮し、再検査、および外部検査機関による抗体検査を依頼し、総合して判定を行う。



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