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生存率・付着率検査


凍結保存後のアンプルを融解し、再培養時の生存率を、 トリパンブルー染色法にて測定しています。
また、付着細胞では、一晩培養後の付着率も測定しています。

1. 準備するもの
・検査対象:凍結細胞
・培地
・遠心チューブ
・培養器具一式
・トリパンブルー染色液
・血球計算盤

2. 方法
4DG生存率・付着率検査_図
(1) 培地5mlを入れた遠心チューブを準備する。
(2) 凍結細胞を、37℃の温水で振りながら、素早く融解する。
(3) 細胞懸濁液を軽くピペッティングし、予め培地を入れた遠心チューブに加える。
(4) 1000rpm、 3分(室温)で遠心し、上清を捨てる。(x2回)
(5) ペレットに培地5mlを加えて懸濁する。
(6) 細胞を播種する。(右図参照)
(7) 生存率を測定する。

生存率(%)= B×5/A ×100

残った細胞懸濁液をトリパンブルーで染色し、生存細胞数をカウントする。

A(cells/tube)= 凍結アンプル1本あたりの凍結生細胞数
          (細胞材料発送時、同梱するデーターシート参照)
B(cells/ml)= 細胞懸濁液1ml中の生存細胞数、とする。

実際の検査では凍結アンプル2本を融解し、
その平均から生存率/付着率を測定している。

(8) 翌日、付着率を測定する。(付着細胞の場合)

付着率(%)= C/B ×100

Φ35mm dish 4枚中、2枚を剥がし、トリパンブルーで染色し、各dishの生存細胞数をカウントする。
C(cells/Φ35mm dish)= カウントした2枚の生存細胞数の平均値、とする。

(9) カウントに使用しなかったdishから継代を行い、少なくとも3週間程度培養し、増殖確認を行う。

2. 結果の判定
各細胞株において、最低3週間培養を行い、増殖性と細胞の形態を確認する。