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融解・凍結方法(簡易ガラス化法)


はじめに

 当室では「ガラス化法(Vitrification法)」を用いてヒトES細胞及びヒトiPS細胞の凍結を行っております。 細胞株の凍結に一般的に良く用いられている、DMSOを用いて1℃/1分程度でゆっくり冷却を行い、細胞を凍結する「緩慢冷却法」と凍結及び融解の手順が大きく異なります。 本項をよく読み、操作手順をよく理解された上で、融解作業を開始することをお願いいたします。

参考文献:

A simple and efficient cryopreservation method for primate embryonic stem cells.
Int J Dev Biol. 2004 Dec;48(10):1149-54.

細胞解離液及び凍結保存に関する特許は(株)リプロセルが保有しております。
【特許番号】特許4317337号、PCT/JP2004/016167
関連製品

霊長類ES細胞用剥離液(RCHETP002)
霊長類ES細胞用凍結保存液(RCHEFM001)

arrow_sヒトiPS 細胞及びヒトES細胞の融解方法動画

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ヒトiPS 細胞及びヒトES細胞の融解方法

ご注意ください

◇ 当室からの送付は通常の細胞輸送用のドライアイス中(約-80℃)ではなく、液体窒素を吸着させた保冷剤により約-170℃以下に冷却したドライシッパーにて発送しています。

◇ ヒトiPS細胞、ES細胞の凍結保存液は液量が少なく(200 μl) 融点が低い(-65℃前後)ため、凍結チューブの温度が-140℃以上に上がらないよう注意し、保管場所から作業用のクリーンベンチに運ぶ際は、たとえ近距離でも、液体窒素を用いて確実に冷却した状態で運んでください。

◇ ガラス化法は凍結保存液の毒性が非常に高く、細胞が作業中に融解した高濃度の凍結保存液に触れる時間ができる限り短くなるように急速に融解し、培地で希釈することが重要です。

液体状態の保存液に触れると、細胞は1分程度でほとんどが死滅してしまいます。凍結チューブを液体窒素から取り出してから、培地に戻すまでの操作を目安として30~40秒程度で行って下さい。

準備するもの

・ ヒトES細胞もしくはヒトiPS細胞を凍結したチューブ(ガラス化法で凍結したもの)

・ フィーダー細胞を播種した培養ディッシュ

  (各細胞株指定のもの。融解後のヒトES及びiPS細胞を播種するため、60 mm dish 2枚程度(1枚は予備)を準備しておく。)

・ ヒトES細胞もしくはヒトiPS細胞培養培地 (各細胞株に応じた、指定の培養培地。)

・ 液化窒素及び運搬容器

・ ピンセット(液化窒素から凍結チューブを取り出す際に使用)

・ 凍結チューブ立て

・ 15 ml遠心チューブ

・ 1000 μlピペットマン及びチップ

・ その他、培養操作に必要な器具

操作手順

(1) 15 ml遠心チューブに培養培地を10 ml入れ、パラフィルムをしてウォーターバスで37℃に温めておく。

(2) 凍結チューブを保管場所から液体窒素を入れた容器に移し、冷却した状態でクリーンベンチまで運ぶ。

(3) 融解直前まで37℃に温めておいた培地をクリーンベンチ内に入れ、融解操作を開始する。

(4) ピンセットで凍結チューブを液体窒素から取り出し、必ず温めた培地1 mlを1000μlマイクロピペットで細胞凍結液に全量を吹きつけるように大きく10回程度ピペッティングを行い、完全に融解後、すぐに細胞懸濁液を(3)の温めた培地に回収する

注) 凍結チューブを液体窒素から取り出してから、培地に戻すまでの操作をできるだけ迅速に行ってください。目安は30~40秒程度。
注) このステップで、冷めた培地の使用、不充分なピペッティング等の要因により、再凍結が起きると生存率が著しく低下します。

(5) 200xG (1,000 rpm)、室温、3分間遠心する。

(6) 上清を除き、培養培地4~5 mlに懸濁後、用意しておいたフィーダー細胞の培養ディッシュに播種して培養を開始する。(凍結チューブ1本に対して60 mm dish 1~2枚)

(7) 培養中は毎日培地交換と観察を行う。

注) 融解翌日に細胞塊が浮遊していることがありますが、60mm dish全体で数十個程度のコロニーの接着が確認できます。接着しているコロニー数が少なく、浮遊しているヒトiPS細胞、ES細胞の細胞塊が多い場合は、上清を遠心して取り除き、細胞を新しい培地に懸濁後、元のディッシュに播き直してください。

(8) ディッシュ全体の7~8割のコロニーが大きくなり、分化を始める前に継代操作を行います。継代時に使用するフィーダー細胞を忘れないように準備しておきます。

arrow_s  送付された細胞材料 (HPS) の再培養方法

融解方法(簡易ガラス化法)

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ヒトiPS 細胞及びヒトES細胞の凍結方法

ご注意ください

◇ 細胞が凍結保存液に触れてから完全に凍結されるまでの時間をできるだけ短くすることが重要です(目安は10~15秒程度)。 実際にサンプルを凍結する作業を開始する前までに、すばやく作業できるように練習しておくことも必要です。 また、重要なサンプルは複数本に分けて凍結することをお奨めします。

◇ コロニーをできるだけ大きな塊のまま剥がして凍結することで、凍結保存効率が上がる傾向にあります。

◇ 剥がした細胞を凍結保存液に懸濁し凍結保存用チューブに移す際に、稀に、細胞塊が1000 μlチップの先に詰まってすばやく操作できなくなることがあります。 細胞を剥がす際に大きなフィーダー細胞の塊があれば、細胞を回収する際にあらかじめ取り除いておくことをお奨めします。

◇ 凍結保存用チューブの温度が-65℃以上に上がるとガラス化状態を保持できず、凍結保存した細胞が全滅してしまうので、取り扱いには細心の注意をお願い致します。 凍結保存した細胞が入った凍結保存用チューブの移動の際も、たとえ数メートル程度の近距離でも液体窒素を用いて確実に冷却して運搬することを徹底してください。

準備するもの

・ コンフルエントになったヒトES細胞もしくはヒトiPS細胞(60 mm dish 1枚程度)

・ ヒトES細胞もしくはヒトiPS細胞培養培地 (各細胞株に応じた、指定の培養培地。)

・ PBS(Ca2+, Mg2+ free)

・ 細胞解離液(0.25% trypsin+0.1% collagenase IV+20% KSR+1mM CaCl2 / PBS(Ca2+, Mg2+ free)

・ 凍結保存液(DAP: 2M DMSO+1M Acetamide+3M Propyleneglycol / medium)

・ 氷及び容器

・ 液化窒素及び運搬容器

・ ピンセット

・ 凍結保存用チューブ

・ 凍結チューブ立て

・ 15 ml遠心チューブ

・ 1000 μlピペットマン及びチップ

・ その他、培養操作に必要な器具

操作手順

(1) コンフルエント状態の細胞を準備する。

(2) 培地を除き、PBSで1回、細胞を洗浄する。

(3) 細胞解離液を添加し、ディッシュ全体になじませた後、CO2インキュベーター中で細胞解離液を反応させ、コロニーを塊状のまま解離させる。

(4) 培地を添加し、ピペッティングをできるだけ行わないように細胞懸濁液を遠心チューブに回収する。 ディッシュに細胞が残っている場合、もう一度新しい培地を加えて残りの細胞を回収する。

(5) 1,000rpm、3分間遠心後、上清を除去する。

(6) 再び遠心し、チューブ側面に残った培養上清を落とした後、完全に除去し、細胞のペレットのみにする。

(7) すばやく操作できる位置に、P-1000ピペットマン、凍結保存液、凍結保存用チューブ、液化窒素を準備する。 凍結保存液は氷上で冷やしておく。

(8) P-1000ピペットマンで、凍結保存液を200 μl量り取る。 (凍結する細胞数に関わらず、凍結保存液の液量は200 μl。)

注) 以降、細胞が凍結保存液に触れてから、液化窒素中で完全に凍結されるまでの工程をできる限りすばやく行うこと。(目標10秒以内)

(9) 細胞を凍結保存液に懸濁後、凍結保存用チューブへ移し、すばやく蓋を閉めて、チューブの底部から2/3までを液化窒素に浸す。

(10) 液化窒素中で十分に冷却約1分程度)し、内部まで完全に凍結する。 チューブはピンセットで保持する。

(11) 液化窒素タンク(気相)もしくは-140℃以下の超低温フリーザーに移し保存する。

凍結方法(簡易ガラス化法)

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