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SSLP


マウス由来細胞株についてマウス系統を同定する検査で、PCRを利用した簡便で信頼性の高い遺伝子多型解析の一つであるSimple Sequence Length Polymorphism(SSLP) 法を用いています。

参考文献
Tsang S, Sun Z, et al. ; Mamm Genome. 2005 Jul; 16(7):476-80. (PMID: 16151692)
Berg KD, et al. ; J Mol Diagn. 2000 Feb; 2(1):20-8. (PMID: 11272898)
Beck JA, et al. ; Nat Genet. 2000 Jan; 24(1):23-5. (PMID: 10615122)

1. 準備するもの

(1) 検体

  • 細胞から抽出したゲノムDNA : 25ng/μlをテンプレートDNAとする。

(2) 機器・PCRプレート等

  • PCR用96wellプレート、プレートカバー
  • トレー/リテーナー(PCR容器に適合するもの)
  • プレートシール(粘着式)
  • サーマルサイクラー(Gold 96-well GeneAmp PCR system 9700、Applied Biosystems)
  • 希釈容器(チューブやプレート等)
  • 96well泳動プレートMicroAmp Optical 96-well Reaction Plate (Applied Biosystems Cat#N8010560 10枚)
  • Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)
  • 3100/3130/3730 96-wellプレートセプタ(Applied Biosystems Cat#4315933 20枚)
  • 3130 36-cm Capillary Array 47cm×50μm 4本/アレイ(Applied Biosystems Cat#4333464)
  • 3100/3130 96-well プレートリテーナー(Applied Biosystems Cat#4317241 4枚)
  • 3130 POP-4 ポリマー(Applied Biosystems Cat#4352755 7.0ml)

(3) PCRプライマー

  • ABI PRISM Mouse Mapping Primers v1.0 (Applied Biosystems 3000pmol 5μM each primer)
プライマー名(略称) マーカー 蛍光標識 カタログ番号
1G D1Mit159.1 VIC(緑) 4323000
2B D2Mit395.1 6-FAM(青) 4323128
23B D4Mit170.1 6-FAM(青) 4323227
4G D5Mit201.1 VIC(緑) 4323237
11Y D13Mit256.1 NED(黄) 4323745
15Y D17Mit51.1 NED(黄) 4323803

※販売中止だが、Primerのカタログ番号から作成してもらえる

(4) 試薬

  • True Allele PCR Premix (Applied Biosystems Cat#403061 2000反応分)
  • GeneScan –500 LIZ Size Standerd (Applied Biosystems Cat#4322682 800レーン分) 蛍光標識はLIZ(橙)
  • Hi-Di formamide(Applied Biosystems Cat#4311320 25ml)
  • Genetic Analyzer Buffer with EDTA(Applied Biosystems Cat#402824 25ml)
  • DDW

2. 方法
(1) PCR
  1) 各プライマー(1G、2B、11Y、23B、15Yの濃度は原液のまま5μM、4Gのみ1/5に希釈し1μM)を1μlずつ、PCR用96 wellプレートのウェルに入れる。
  2) True Allele PCR Premix希釈液を各ウェルに11.6μlずつ加える。

  • True Allele PCR Premix希釈液の組成
DDW 2.6μl
True Allele PCR Premix 9.0μl

希釈液の液量 11.6μl

  3) 検体をDDWで25ng/μlに希釈し、各ウェルに2.4μlずつ加える。
  4) PCR用96 wellプレートをトレー/リテーナーと共にサーマルサイクラーにセットする。
  5) PCR program
   Ramp Speed : 9600
   Stage1 : 95℃ 12分(1サイクル)
   Stage2 : 94℃ 20秒 → 55℃ 20秒 → 72℃ 30秒(10サイクル)
   Stage3 : 89℃ 20秒 → 55℃ 20秒 → 72℃ 30秒(20サイクル)
   Stage4 : 72℃ 10分(1サイクル)
   Stage5 : 4℃ (保存)

(2) 増幅断片のキャピラリー電気泳動
青、黄、緑3色の増幅サンプルはマーカーグループごとに1本にまとめて泳動する。

  • Group1  1G 2B 11Y
  • Group3  4G 15Y 23B

  1) 増幅サンプルを2μlずつ希釈容器に移す。この時グループごとに3ウェルのサンプルを1本(又は1ウェル)にまとめる。
  2) DDWを14μlずつ加え、ピペッティングにより混和する。(各増幅サンプルが1/10希釈になる。)
  3) 泳動カクテルを調製する。
   ※ 泳動サンプル数は1検体につき2サンプル。

  • 泳動カクテルの組成
1サンプルあたりの液量
脱イオン化ホルムアミド 19.5μl
Size Standard 0.5μl

カクテルの液量 20.0μl

  4) 泳動カクテルを10~15秒間ミキサーで攪拌し、泳動用プレートに20μlずつ分注する。
  5) 増幅サンプル希釈液を1μlずつ加える。
  6) セプタストリップで蓋をし、95℃、3分間加熱後、直ちに氷上に移し3分間冷却する。
  7) サンプルプレートの上にプレートリテーナーをはめる。
  8) 装置(3130 Genetic Analyzer)にかけ泳動を行う。

(3) 解析
ABI PRISM GeneMapper v4.0にて解析を行う。

解析例