細胞検索

細胞検索
各種 索引一覧もあります。
キーワード:
※ しぼり込み検索は、単語と単語の間にスペース(半角空白文字)を入力して下さい。
  
Update information

●新規提供株のリストはこちら
オンラインカート停止のお知らせ

細胞材料の提供について

提供までのフロー図
提供申込み
リソースの提供手数料
細胞発送予定日
12月19日(火)が年内最終発送日です。
1月9日(火)の発送分の申込締切は、
 12月27日(水)17時到着分までです。
細胞材料の送付
送付された細胞材料の再培養方法
ガラスアンプル融解方法
送付された細胞材料の再培養方法 (HPS・HES)
培養マニュアル
品質検査
よくある質問(FAQ)

お願い

• メールでお問い合わせいただく場合は、タイトルの先頭に細胞の2文字の入力をお願い致します。
• MAIL NEWS送信にお申し込み下さい。
(新着情報等が配信されます)


各種お問い合わせ先

細胞の凍結方法(HPS・HES)


はじめに

当室では「ガラス化法(Vitrification法)」を用いてヒトiPS細胞およびヒトES細胞(以下、HPS・HES)の凍結を行っております。 細胞株の凍結に一般的に良く用いられている、DMSOを用いて1℃/1分程度でゆっくり冷却を行い、細胞を凍結する「緩慢冷却法」と凍結の手順が大きく異なります。(参考文献参照)。



ヒトiPS 細胞およびヒトES細胞(HPS・HES)の凍結方法

ご注意ください

  • 細胞が凍結保存液に触れてから完全に凍結されるまでの時間をできるだけ短くすることが重要です(目安は10~15秒程度)。 実際にサンプルを凍結する作業を開始する前までに、すばやく作業できるように練習しておくことも必要です。 また、重要なサンプルは複数本に分けて凍結することをお奨めします。
  • コロニーをできるだけ大きな塊のまま剥がして凍結することで、凍結保存効率が上がる傾向にあります。
  • 剥がした細胞を凍結保存液に懸濁し凍結保存用チューブに移す際に、稀に、細胞塊が1000 μlチップの先に詰まってすばやく操作できなくなることがあります。 細胞を剥がす際に大きなフィーダー細胞の塊があれば、細胞を回収する際にあらかじめ取り除いておくことをお奨めします。
  • 凍結保存用チューブの温度が-65℃以上に上がるとガラス化状態を保持できず、凍結保存した細胞が全滅してしまうので、取り扱いには細心の注意をお願い致します。 凍結保存した細胞が入った凍結保存用チューブの移動の際も、たとえ数メートル程度の近距離でも液体窒素を用いて確実に冷却して運搬することを徹底してください。

準備するもの

  • コンフルエントになったHPS・HES(60 mm dish 1枚程度)
  • HPS・HES培養培地 (各細胞株に応じた、指定の培養培地。)
  • PBS(Ca2+, Mg2+ free)
  • 細胞解離液(0.25% trypsin+0.1% collagenase IV+20% KSR+1mM CaCl2 / PBS(Ca2+,Mg2+ free)
  • 凍結保存液(DAP213: 2M DMSO+1M Acetamide+3M Propyleneglycol / medium)
  • 氷及び容器
  • 液化窒素及び運搬容器
  • ピンセット
  • 凍結保存用チューブ
  • 凍結チューブ立て
  • 15 ml遠心チューブ
  • 1000 μlピペットマン及びチップ
  • その他、培養操作に必要な器具

操作手順

  1. コンフルエント状態の細胞を準備する。
  2. 培地を除き、PBSで1回、細胞を洗浄する。
  3. 細胞解離液を添加し、ディッシュ全体になじませた後、CO2インキュベーター中で細胞解離液を反応させ、コロニーを塊状のまま解離させる。
  4. 培地を添加し、ピペッティングをできるだけ行わないように細胞懸濁液を遠心チューブに回収する。 ディッシュに細胞が残っている場合、もう一度新しい培地を加えて残りの細胞を回収する。
  5. 1,000rpm、3分間遠心後、上清を除去する。
  6. 再び遠心し、チューブ側面に残った培養上清を落とした後、完全に除去し、細胞のペレットのみにする。
  7. すばやく操作できる位置に、P-1000ピペットマン、凍結保存液、凍結保存用チューブ、液化窒素を準備する。 凍結保存液は氷上で冷やしておく。
  8. P-1000ピペットマンで、凍結保存液を200 μl量り取る。 (凍結する細胞数に関わらず、凍結保存液の液量は200 μl。)
    注) 以降、細胞が凍結保存液に触れてから、液化窒素中で完全に凍結されるまでの工程をできる限りすばやく行うこと。 (目標10~15秒以内)

  9. 細胞を凍結保存液に懸濁後、凍結保存用チューブへ移し、すばやく蓋を閉めて、チューブの底部から2/3までを液化窒素に浸す。
  10. 液化窒素中で十分に冷却(約1分程度)し、内部まで完全に凍結する。 チューブはピンセットで保持する。
  11. 液化窒素タンク(気相)もしくは-140℃以下の超低温フリーザーに移し保存する。

融解方法(簡易ガラス化法)

より鮮明な動画をダウンロード(wmv/26.7MB)より鮮明な動画をダウンロード(wmv/26.7MB)

参考文献
A simple and efficient cryopreservation method for primate embryonic stem cells.
Int J Dev Biol. 2004 Dec;48(10):1149-54.

細胞解離液及び凍結保存に関する特許は(株)リプロセルが保有しております。
【特許番号】特許4317337号、PCT/JP2004/016167
関連製品
霊長類ES細胞用剥離液(RCHETP002)
霊長類ES細胞用凍結保存液(RCHEFM001)