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STR


ヒト細胞材料の由来個体の識別同定、起源の確認、クロスコンタミネーションなどを確認するために、Short Tandem Repeat (STR) 多型解析を行っています。この検査方法はPCRを利用した簡便で信頼性の高い遺伝子多型解析方法の一種です。
当室が保有している全ヒト由来細胞株(当室で培養を行わないものを除く)に関してSTR検査を実施して提供しています。

1. 準備するもの

(1) 検体

  • 検査細胞株から抽出したゲノムDNA

(2) 機器・PCRチューブ

  • PCRチューブ( 0.2ml PCRチューブ、PCR用96ウェルプレート等)
  • トレー/リテーナー(PCR容器に適合するもの)
  • サーマルサイクラー(Gold 96-well GeneAmp PCR system 9700、Applied Biosystems)
  • 96well泳動プレートMicroAmp Optical 96-well Reaction Plate (Applied Biosystems Cat#N8010560 10枚)
  • Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)
  • 3100/3130/3730 96-wellプレートセプタ(Applied Biosystems Cat#4315933 20枚)
  • 3130 36-cm Capillary Array 47cm×50μm 4本/アレイ(Applied Biosystems Cat#4333464)
  • 3100/3130 96-well プレートリテーナー(Applied Biosystems Cat#4317241 4枚)

(3) PCR Primer

  • PowerPlex 16 HS System (Promega Cat#DC2101)
    Krenke, Benjamin E., et al. “Validation of a 16-locus fluorescent multiplex system.” Journal of forensic sciences 47.4 (2002): 773-785.

(4) 試薬

  • PowerPlex 16 HS System (Promega Cat#DC2101)
      キット内容(使用する試薬のみ抜粋)
       PowerPlex HS 5×Master Mix
       PowerPlex 16 HS 10×Primer Pair Mix
       PowerPlex 16 HS Allelic Ladder Mix
       Internal Lane Standard(ILS)600

  • Hi-Di formamide(Applied Biosystems Cat#4311320 25ml)
  • POP-4 ポリマー(Applied Biosystems Cat#4352755 7.0ml)
  • Genetic Analyzer Buffer with EDTA(Applied Biosystems Cat#402824 25ml)
  • DDW

2. 方法

(1) 1st-step PCR
  1)PCRマスターミックスを調製する。

1サンプルあたりの液量
DDW 17.0μl
PowerPlex HS 5×Master Mix 5.0μl
PowerPlex 16 HS 10×Primer Pair Mix 2.5μl

マスターミックスの液量 24.5μl

  2)PCRチューブにマスターミックスを24.5μlずつ分注する。
  3)約1ng/μlに希釈したテンプレートDNAを0.5μlずつ加える。
  4)PCRチューブをトレー/リテーナーと共にサーマルサイクラーにセットし、下記のサイクルで反応させる。

Ramp Speed : 9600
95℃ 11min
96℃ 1min
ramp 100% 94℃ 30sec for 10 cycle
ramp 29% 60℃ 30sec
ramp 23% 70℃ 45sec
ramp 100% 90℃ 30sec for 20 cycle
ramp 29% 60℃ 30sec
ramp 23% 70℃ 45sec
60℃ 30min
4℃ store

(2) 増幅断片のキャピラリー電気泳動

  1)泳動カクテルを調製する。
   泳動サンプル数は、検体数+ネガティブコントロール2サンプル+Ladderサンプル数である。

1サンプルあたりの液量
脱イオン化ホルムアミド 9.75μl
Internal Lane Standard(ILS)600 0.25μl

カクテルの液量 10.00μl

  2)泳動カクテルを10~15秒間ミキサーで攪拌し、泳動用プレートに10μlずつ分注する。
  3)増幅サンプル又はPowerPlex 16 HS Allelic Ladder Mixを1μlずつ加える。
  4)セプタストリップで蓋をし、95℃、3分間加熱後、直ちに氷上に移し3分間冷却する。
  5)サンプルプレートの上にプレートリテーナーをはめる。
  6)装置(3130 Genetic Analyzer)にかけ泳動を行う。

(3) データ及び解析
GeneMapper IDソフトウェア(Applied Biosystems)にて解析を行なう。

a) PowerPlex® 16 HS Allelic Ladder:PowerPlex 16 HS System付属のアレリックラダーマーカー

b) RCB0007 HeLa Lot 46の結果
同じローカスのアレリックラダーと機器により比較することで、アレルの割り当てが行なわれる。

(4) 判定
データベースのデータと照合、確認をする。
細胞認証データベースhttp://jcrbcelldata.nibiohn.go.jp/str/

  1)細胞株の判定

   識別同定により合格

  • 登録済みの他の細胞株の中に一致するものがない→固有の細胞 
  • 登録済みの他の細胞株の中に一致するものがあっても、文献上別名で認知されている細胞の場合
    →OKとなる場合もある

   識別同定により不合格

  • 登録済みの他の細胞株の中に一致するものがある→取り違い
  • プロットデータ中に登録済みの他の細胞株のデータと一致するものがある→他の細胞混入の疑い

  2)≪ 他の細胞の混入例≫ サンプル細胞Cは、細胞Aと細胞Bが混ざっている。