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動物種を同定するPCR検査


細胞株の由来動物種の同定と判別可能な動物種(注1)の混入などのクロスコンタミネーションの有無を確認するため、動物種を同定するPCR検査をしています。現在、細胞培養に広範に用いられる動物種13種について動物種の判定が可能です。
注1)判別可能な動物種
ヒト、マウス、ラット、ニワトリ、シリアンハムスター、アフリカミドリザル、カニクイザル、ウサギ、チャイニーズハムスター、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ

内部コントロールプライマー ( 18SrRNA ) と動物種特異的プライマーを用いて、細胞中に含まれるミトコンドリアDNA の各動物特異的配列をPCR法で検出することにより、動物種を同定しています。短時間で同定することができますが、微量の混入は検出限界があるため検出されないこともあります。

<参考文献>
In Vitro Cell.Dev.Biol.—Animal (2007) 43:168–175

1. 準備するもの

(1)検体

  • 検査細胞株から抽出したゲノムDNA
  • 陰性対照:PCRマスターミックス作成時に使用した蒸留精製水
  • クロスコンタミネーション確認のための陽性対照(一般に取り扱いの多い動物種)
    • 陽性対照1:ヒトのDNA
    • 陽性対照1:マウスのDNA
    • 陽性対照1:ラットのDNA
  • 検査細胞株の動物種同定のための陽性対照(陽性対照1以外の動物種の場合)
  • 陽性対照2:検査細胞株と同じ動物種のDNA
          ヒト、マウス、ラットの場合は陽性対照1で兼ねる。

(2)機器とPCRチューブ

  • PCRチューブ( 0.2ml PCRチューブ、PCR用96ウェルプレート等)
  • トレー/リテーナー( PCR容器に適合するもの )
  • サーマルサイクラー( Gold 96-well GeneAmp PCR system 9700 、Applied Biosystems )
  • アガロースゲル電気泳動装置( Mupidシリーズ ADVANCE )
  • ゲルトレイ 、コーム( ゲルトレイ-L 25well、ゲルトレイ-S 12wellのサイズ)

(3)プライマー一覧

動物種   プライマー名 配列 サイズ(bp) 参照配列
Human FW S31_Human_F2 CTCCTATTCTTGCACGAAAC 330 NC 001807
RV S53_Human_R7 GATGGGGATTATTGCTAGGATG
Mouse FW S07_Mouse_F GCACTGAAAATGCTTAGATGGATAATTG 948 NC 005089
RV S08_Mouse_R CCTCTCATAAACGGATGTCTAG
Rat FW S29_Rat_F2 CAATTCTCCTAGCACAAGTG 493 NC 001665.2
RV S30_Rat_R2 CCCCAACCGAAATTTTTTAGTTC
Chicken FW S27_Chicken_F GTATTCCCGTGCAAAAACGAG 197 AB086102
RV S28_Chicken_R CTTAGTGAAGAGTTGTGGTCTG
Syrian hamster FW S11_S. hamster_F GACCTCTTAGGTGTATTCCTAC 245 AF119265
RV S12_S. hamster_R GTATGAAGAAGGGGTAGAGCA
African green monkey FW S54_A. monkey_F3 AAATCAAGGCATAGCTTAACGC 576 AY863426.1
RV S55_A. monkey_R3 GGCCAACTATGGTAGTTATGGT
Cynomolgus monkey FW S43_C. monkey_F3 CCTAAACCTCAGTAGTTAGATA 577 AF424970
RV S44_C. monkey_R3 CTCAAGGTAATCAAGTGGTAT
Rabbit FW S35_Rabbit_F2 CGGACATTAAGCACACTAATC 591 NC 001913
RV S36_Rabbit_R2 CATTGCTCTCCACTCTATGG
Chinese hamster FW S13_C. hamster_F CCGGCGTAAAACGTGTTATAGACT 601 DQ390542
RV S14_C. hamster_R GTATTAGGTATAATATCGGCAGTC
Dog FW S19_Dog_F GCCCAACTAACCCCAAACTTA 755 AY729880
RV S20_Dog_R GGTTAACAATGGGGTGGATAAG
Pig FW S25_Pig_F CCTATATTCAATTACACAACCATGC 819 AY337045
RV S26_Pig_R GCGTGTGCGAGGAGAAAGGC
Cow FW S23_Cow_F CCTAGATGAGTCTCCCAACTC 1090 AB074965
RV S24_Cow_R GTTGTTTAGTCGAGAGGGTATC
Cat FW S39_Cat_F2 TTATCACACCCACAAGAGGA 1355 NC 001700
RV S40_Cat_R2 GTAGTACTTTCGACTGGTTAG
内部コントロール
18SrRNA
FW I01_IC_F CGGGGAATYAGGGTTCGATTC 70  
RV I02_IC_R GCCTGCTGCCTTCCTTKGATG

*全てのプライマーの希釈はTEで行う。

(4)試薬

  • Ex Taq Hot Start Version( TaKaRa Cat#RR006A )
    ( 10×Ex Taq Buffer 、2.5mM dNTP Mix 付属 )
  • TE Buffer( 10mM Tris-HCl(pH8.0) 、1mM EDTA (pH8.0) )
  • 2% アガロースゲル
  • 50×TAE Buffer(2M Tris, 2M氷酢酸, 0.5M EDTA (pH8.0))
    使用時、精製水で50倍希釈する。(1×TAE)
  • 精製水
  • 10×Loading Buffer
  • DNAサイズマーカー( 100bp DNA Ladder )
  • 10mg/mlエチジウムブロマイド溶液
    10mg/mLエチジウムブロマイド10μLをTAE Buffer 100mLに加える。

2.方法
(1)PCR

1) PCR mixtureを調整し、PCR用96ウェルプレート( または0.2mlチューブ )に46μlずつ分注する。

精製水 32.5 μl
10× Ex Taq buffer 5 μl
2.5 mM dNP 4 μl
動物種特異的プライマーFW (10pmol/ul) 1 μl
動物種特異的プライマーRW (10pmol/ul) 1 μl
内部コントロールプライマーFW (2pmol/ul) 1 μl
内部コントロールプライマーRW (2pmol/ul) 1 μl
Ex Taq HS 0.25 μl

Total 46 μl

2) 陰性対照は、1)のPCR用96ウェルプレート( または0.2mlチューブ )に精製水4ulを加える。
3) 検査細胞株から抽出したゲノムDNA及び陽性対照は、精製水で25ng/μlになるように希釈し、1)の96ウェルプレート( または0.2mlチューブ )に4μl加える。
4) 攪拌処理を行い、スピンダウンを行う。
5) PCR program
  Stage1 : 94℃ 5分( 1サイクル )
  Stage2 : 94℃ 45秒 → 60℃ 30秒 → 72℃ 1.5分 ( 30サイクル )
  Stage3 : 72℃ 10分( 1サイクル )
  Stage4 : 4℃( 保存 )

(2)電気泳動
電気泳動

3.判定
陰性対照にはバンドがないこと、陰性対照以外には内部コントロール(70bp)のバンドが出ていること、陽性対照にプライマー一覧に記載のサイズのバンドが出ていることを確認後、動物種の判定をする。
すべての陽性対照にバンドが出ていない場合、内部コントロールのバンドが出ていない場合は、再度PCRを行う。

陽性(+) 陽性対照と同じサイズのバンドが検出されたときは陽性(+)とし、陽性対照と同じ動物種と判定する。
陰性(-) 陽性対照と同じサイズのバンドが検出されないときは陰性(-)とする。

*目的とする動物種以外の動物種でバンドが検出された場合は、検査細胞株に他種細胞が混入している可能性と、細胞の由来が目的とする動物種以外であることが疑われる。