細胞株の由来動物種の同定と判別可能な動物種（注1）の混入などのクロスコンタミネーションの有無を確認するため、動物種を同定するPCR検査をしています。現在、細胞培養に広範に用いられる動物種13種について動物種の判定が可能です。
注1）判別可能な動物種
ヒト、マウス、ラット、ニワトリ、シリアンハムスター、アフリカミドリザル、カニクイザル、ウサギ、チャイニーズハムスター、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ
内部コントロールプライマー ( 18SrRNA ) と動物種特異的プライマーを用いて、細胞中に含まれるミトコンドリアDNA の各動物特異的配列をPCR法で検出することにより、動物種を同定しています。短時間で同定することができますが、微量の混入は検出限界があるため検出されないこともあります。
＜参考文献＞
In Vitro Cell.Dev.Biol.—Animal (2007) 43:168–175
1. 準備するもの
(1)検体
- 検査細胞株から抽出したゲノムDNA
- 陰性対照：PCRマスターミックス作成時に使用した蒸留精製水
- クロスコンタミネーション確認のための陽性対照（一般に取り扱いの多い動物種）
- 陽性対照1：ヒトのDNA
- 陽性対照1：マウスのDNA
- 陽性対照1：ラットのDNA
- 検査細胞株の動物種同定のための陽性対照（陽性対照1以外の動物種の場合）
- 陽性対照2：検査細胞株と同じ動物種のDNA
ヒト、マウス、ラットの場合は陽性対照１で兼ねる。
(2)機器とPCRチューブ
- PCRチューブ（ 0.2ml PCRチューブ、PCR用96ウェルプレート等）
- トレー/リテーナー（ PCR容器に適合するもの ）
- サーマルサイクラー（ Gold 96-well GeneAmp PCR system 9700 、Applied Biosystems ）
- アガロースゲル電気泳動装置（ Mupidシリーズ ADVANCE ）
- ゲルトレイ 、コーム（ ゲルトレイ-L 25well、ゲルトレイ-S 12wellのサイズ）
(3)プライマー一覧
| 動物種 | プライマー名 | 配列 | サイズ(bp) | 参照配列 | |
|---|---|---|---|---|---|
| Human | FW | S31_Human_F2 | CTCCTATTCTTGCACGAAAC | 330 | NC 001807 |
| RV | S53_Human_R7 | GATGGGGATTATTGCTAGGATG | |||
| Mouse | FW | S07_Mouse_F | GCACTGAAAATGCTTAGATGGATAATTG | 948 | NC 005089 |
| RV | S08_Mouse_R | CCTCTCATAAACGGATGTCTAG | |||
| Rat | FW | S29_Rat_F2 | CAATTCTCCTAGCACAAGTG | 493 | NC 001665.2 |
| RV | S30_Rat_R2 | CCCCAACCGAAATTTTTTAGTTC | |||
| Chicken | FW | S27_Chicken_F | GTATTCCCGTGCAAAAACGAG | 197 | AB086102 |
| RV | S28_Chicken_R | CTTAGTGAAGAGTTGTGGTCTG | |||
| Syrian hamster | FW | S11_S. hamster_F | GACCTCTTAGGTGTATTCCTAC | 245 | AF119265 |
| RV | S12_S. hamster_R | GTATGAAGAAGGGGTAGAGCA | |||
| African green monkey | FW | S54_A. monkey_F3 | AAATCAAGGCATAGCTTAACGC | 576 | AY863426.1 |
| RV | S55_A. monkey_R3 | GGCCAACTATGGTAGTTATGGT | |||
| Cynomolgus monkey | FW | S43_C. monkey_F3 | CCTAAACCTCAGTAGTTAGATA | 577 | AF424970 |
| RV | S44_C. monkey_R3 | CTCAAGGTAATCAAGTGGTAT | |||
| Rabbit | FW | S35_Rabbit_F2 | CGGACATTAAGCACACTAATC | 610 | NC 001913 |
| RV | S36_Rabbit_R2 | CATTGCTCTCCACTCTATGG | |||
| Chinese hamster | FW | S13_C. hamster_F | CCGGCGTAAAACGTGTTATAGACT | 601 | DQ390542 |
| RV | S14_C. hamster_R | GTATTAGGTATAATATCGGCAGTC | |||
| Dog | FW | S19_Dog_F | GCCCAACTAACCCCAAACTTA | 755 | AY729880 |
| RV | S20_Dog_R | GGTTAACAATGGGGTGGATAAG | |||
| Pig | FW | S25_Pig_F | CCTATATTCAATTACACAACCATGC | 819 | AY337045 |
| RV | S26_Pig_R | GCGTGTGCGAGGAGAAAGGC | |||
| Cow | FW | S23_Cow_F | CCTAGATGAGTCTCCCAACTC | 1090 | AB074965 |
| RV | S24_Cow_R | GTTGTTTAGTCGAGAGGGTATC | |||
| Cat | FW | S39_Cat_F2 | TTATCACACCCACAAGAGGA | 1355 | NC 001700 |
| RV | S40_Cat_R2 | GTAGTACTTTCGACTGGTTAG | |||
| 内部コントロール 18SrRNA |
FW | I01_IC_F | CGGGGAATYAGGGTTCGATTC | 70 | |
| RV | I02_IC_R | GCCTGCTGCCTTCCTTKGATG |
＊全てのプライマーの希釈はTEで行う。
(4)試薬
- Ex Taq Hot Start Version（ TaKaRa Cat#RR006A ）
( 10×Ex Taq Buffer 、2.5mM dNTP Mix 付属 ) - TE Buffer（ 10mM Tris-HCl(pH8.0) 、1mM EDTA (pH8.0) ）
- 2% アガロースゲル
- 50×TAE Buffer（2M Tris, 2M氷酢酸, 0.5M EDTA (pH8.0)）
使用時、精製水で50倍希釈する。（1×TAE） - 精製水
- 10×Loading Buffer
- DNAサイズマーカー（ 100bp DNA Ladder ）
- 10mg/mlエチジウムブロマイド溶液
10mg/mLエチジウムブロマイド10μLをTAE Buffer 100mLに加える。
2.方法
(1)PCR
1) PCR mixtureを調整し、PCR用96ウェルプレート( または0.2mlチューブ )に46μlずつ分注する。
| 精製水 | 32.5 μl |
| 10× Ex Taq buffer | 5 μl |
| 2.5 mM dNP | 4 μl |
| 動物種特異的プライマーFW (10pmol/ul) | 1 μl |
| 動物種特異的プライマーRW (10pmol/ul) | 1 μl |
| 内部コントロールプライマーFW (2pmol/ul) | 1 μl |
| 内部コントロールプライマーRW (2pmol/ul) | 1 μl |
| Ex Taq HS | 0.25 μl |
|
|
|
| Total | 46 μl |
2) 陰性対照は、1)のPCR用96ウェルプレート( または0.2mlチューブ )に精製水4ulを加える。
3) 検査細胞株から抽出したゲノムDNA及び陽性対照は、精製水で25ng/μlになるように希釈し、1)の96ウェルプレート( または0.2mlチューブ )に4μl加える。
4) 攪拌処理を行い、スピンダウンを行う。
5) PCR program
Stage1 : 94℃ 5分（ 1サイクル ）
Stage2 : 94℃ 45秒 → 60℃ 30秒 → 72℃ 1.5分 ( 30サイクル )
Stage3 : 72℃ 10分（ 1サイクル ）
Stage4 : 4℃（ 保存 ）
(2)電気泳動
3.判定
陰性対照にはバンドがないこと、陰性対照以外には内部コントロール（70bp）のバンドが出ていること、陽性対照にプライマー一覧に記載のサイズのバンドが出ていることを確認後、動物種の判定をする。
すべての陽性対照にバンドが出ていない場合、内部コントロールのバンドが出ていない場合は、再度PCRを行う。
| 陽性（＋） | 陽性対照と同じサイズのバンドが検出されたときは陽性（＋）とし、陽性対照と同じ動物種と判定する。 |
| 陰性（－） | 陽性対照と同じサイズのバンドが検出されないときは陰性（－）とする。 |
＊目的とする動物種以外の動物種でバンドが検出された場合は、検査細胞株に他種細胞が混入している可能性と、細胞の由来が目的とする動物種以外であることが疑われる。
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