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血清(FBS)の検定法


血清は、製造元、Lot毎にかなりの差があるので、必ず検定をして用いる。数種類のテスト用サンプルを業者から提供してもらう。

検定は、増殖曲線とコロニー形成率の結果を、検定済みの対照(従来品等)の血清と比較して判定する。 検定する血清が多数ある場合は、まずVeroの増殖曲線をスタンダードと比較して5種程度に絞る。 次にL929,NB1RGBを用いて同様に増殖曲線をとる。コロニー形成率により最終決定をする。

判定に際しては、血清の質や安定化も考慮する。

例:増殖曲線 – Vero,L929,NB1RGBなど、
  コロニー形成法 – BALB/3T3 clone A31,HUC-Fなど

*注意:下の細胞数は参考の数で、細胞によって変えること。

 

(a)増殖曲線

(1)  基礎培地に各々の血清を2倍濃度含むように培地を調整する。

(2)  各々の培地を35mmdishに1mlずつ分注し、インキュベータに入れておく。
   1点当たり2枚のdishを用意する。

(3)  細胞をトリプシン処理する。
   ただし、トリプシンの中和にはFBS以外の血清を使用する。

(4)  細胞浮遊液を1000rpm、3min遠心する。

(5)  沈殿に血清を含まない培地を加えて再び遠心をする。

(6)  沈殿に血清を含まない培地を加えて細胞数を数える。

(7)  3~5×104cells/mlになるように血清を含まない培地で希釈する。ただし、細胞の播種数は参考の値であり、細胞種によって変えること。

(8)  (2)の35mmディッシュに1mlずつ分注する。

(9)  1,2,3,4,6日目に細胞数を数える。

 

(b) コロニー形成率

細胞の播種数は、それぞれの細胞のコロニー形成能によって加減する。
細胞種によってはfeeder細胞が必要となる。
スタンダードの血清で、50~100個/60mmdishのコロニー数が数え安く、ばらつきが少ないので信頼できる。

(1) 基礎培地に各々の血清を2倍濃度含むように培地を調整する。

(2) 各々の培地を60mmdishに2.5mlずつ分注し、インキュベーターに入れておく。
1サンプル当たり5枚のdishを用意する。

<feeder細胞が必要な場合>

(3) 細胞にX線を照射する。(5000R)
(4) 照射後、細胞をトリプシン処理する。但し、トリプシン中和にはFBS以外の血清を使用。
(5) 細胞浮遊液を1000 rpm、3min 遠心。
(6) 沈殿(細胞)に血清不含培地を加えて再び遠心。
(7) 沈殿に血清不含培地を加えて、細胞数を数える。
(8) 2~3×104cells/1.5mlに、血清不含培地で希釈。
(9) (2)の60mmdishに、1.5mlずつ播種し再びインキュベーターに入れる。
<feeder細胞が必要でない場合>

(10) コロニー形成用
(2)の60mmdishに血清を含まない培地を1.5mlずつ分注し、インキュベーターへ。
(11) 細胞をトリプシン処理する。但し、トリプシン中和にはFBS以外の血清使用。
(12) 細胞浮遊液を1000rpm,3min遠心。
(13) 沈殿に血清不含培地を加えて再び遠心。
(14) 沈殿に血清不含培地を添加。
(15) 150~300cells/mlに血清不含培地で希釈。
(16) (9)又は(10)の60mmdishに、1mlずつ播種。
(17) 10~14日間培養後、固定染色。
(18) 50個以上の細胞数があるコロニーを1個と数えコロニー形成率を求める。

※その他の血清についても、その血清を用いる細胞を用いて同様に行う。