細胞材料開発室　-CELL BANK-

血清は、製造元、Lot毎にかなりの差があるので、必ず検定をして用いる。数種類のテスト用サンプルを業者から提供してもらう。

検定は、増殖曲線とコロニー形成率の結果を、検定済みの対照(従来品等)の血清と比較して判定する。 検定する血清が多数ある場合は、まずVeroの増殖曲線をスタンダードと比較して5種程度に絞る。 次にL929,NB1RGBを用いて同様に増殖曲線をとる。コロニー形成率により最終決定をする。

判定に際しては、血清の質や安定化も考慮する。

例：増殖曲線 – Vero,L929,NB1RGBなど、
　　コロニー形成法 – BALB/3T3 clone A31,HUC-Fなど

＊注意：下の細胞数は参考の数で、細胞によって変えること。

 

(a)増殖曲線

(1) 　基礎培地に各々の血清を2倍濃度含むように培地を調整する。

(2) 　各々の培地を35mmdishに1mlずつ分注し、インキュベータに入れておく。
　　　1点当たり2枚のdishを用意する。

(3) 　細胞をトリプシン処理する。
　　　ただし、トリプシンの中和にはFBS以外の血清を使用する。

(4) 　細胞浮遊液を1000rpm、3min遠心する。

(5) 　沈殿に血清を含まない培地を加えて再び遠心をする。

(6) 　沈殿に血清を含まない培地を加えて細胞数を数える。

(7) 　3～5×10⁴cells/mlになるように血清を含まない培地で希釈する。ただし、細胞の播種数は参考の値であり、細胞種によって変えること。

(8) 　(2)の35mmディッシュに1mlずつ分注する。

(9) 　1,2,3,4,6日目に細胞数を数える。

 

(b) コロニー形成率

細胞の播種数は、それぞれの細胞のコロニー形成能によって加減する。
細胞種によってはfeeder細胞が必要となる。
スタンダードの血清で、50～100個/60mmdishのコロニー数が数え安く、ばらつきが少ないので信頼できる。

(1)　基礎培地に各々の血清を2倍濃度含むように培地を調整する。

(2)　各々の培地を60mmdishに2.5mlずつ分注し、インキュベーターに入れておく。
1サンプル当たり5枚のdishを用意する。

＜feeder細胞が必要な場合＞ (3) 細胞にX線を照射する。(5000R) (4) 照射後、細胞をトリプシン処理する。但し、トリプシン中和にはFBS以外の血清を使用。 (5) 細胞浮遊液を1000 rpm、3min 遠心。 (6) 沈殿(細胞)に血清不含培地を加えて再び遠心。 (7) 沈殿に血清不含培地を加えて、細胞数を数える。 (8) 2～3×104cells/1.5mlに、血清不含培地で希釈。 (9) (2)の60mmdishに、1.5mlずつ播種し再びインキュベーターに入れる。

＜feeder細胞が必要でない場合＞ (10) コロニー形成用 (2)の60mmdishに血清を含まない培地を1.5mlずつ分注し、インキュベーターへ。 (11) 細胞をトリプシン処理する。但し、トリプシン中和にはFBS以外の血清使用。 (12) 細胞浮遊液を1000rpm,3min遠心。 (13) 沈殿に血清不含培地を加えて再び遠心。 (14) 沈殿に血清不含培地を添加。 (15) 150～300cells/mlに血清不含培地で希釈。 (16) (9)又は(10)の60mmdishに、1mlずつ播種。 (17) 10～14日間培養後、固定染色。 (18) 50個以上の細胞数があるコロニーを1個と数えコロニー形成率を求める。

※その他の血清についても、その血清を用いる細胞を用いて同様に行う。