EBウイルス（Epstein-Barr virus）は、伝染性単核球症（Infectious mononucleosis）の原因ウイルスとして知られていますが、バーキットリンパ腫、上咽頭癌など悪性腫瘍とも関連しているため、ヒト血液由来細胞株（EBV形質転換B細胞株を除く）やEBV感染が癌発症の原因との報告があるヒト癌細胞株（口腔癌、食道癌、胃癌）について、EBVのBMLF-1遺伝子を標的としたプライマーを用いて、培養細胞ゲノムにインテグレートされたEBVプロウイルスを PCRによって検出しています。
1. 準備するもの
(1) 検体
- サンプル ：抽出ゲノムDNA溶液
- 陰性対照1：PCR mixture及びDNA希釈に用いた精製水
- 陰性対照2：過去の検査でEBV陰性であった検体
- 陽性対照 ：過去の検査でEBV陽性であった検体
（抽出後の濃度測定で30μg/μl以上であったゲノムDNAは精製水で10倍希釈して用いる。30μg/μl未満は希釈せず用いる）
(2) 機器
- サーマルサイクラー（Gold 96-well GeneAmp PCR system 9700、Applied Biosystems）
(3)PCRプライマー
- EBVプライマー
F-EBV(TC-70) forward 5’-CTTGGAGACAGGCTTAACCAGACTCA-3’
R-EBV(TC-72) reverse 5’-CCATGGCTGCACCGATGAAAGTTAT-3’ - 内部コントロールプライマー
β-globin forward 5’-GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG-3’
β-globin reverse 5’-TGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG-3’
参考文献 ： C.C. Uphoff et al., Journal of Biomedicine and Biotechnology, Vol. 2010 (2010), Article ID 904767
2. 方法
(1) PCRマスターミックス
| DDW | 14.25µl |
| Forward プライマー[F-EBV(TC-70) or β-globin forward](10pmol/µl) | 0.5µl |
| Reverse プライマー[R-EBV(TC-72) or β-globin reverse](10pmol/µl) | 0.5µl |
| 10 x Ex Taq Buffer | 2.5µl |
| 2.5mM each dNTP mix | 2.0µl |
| Ex Taq Hot Start Version | 0.25µl |
|
|
|
| Total | 20.0µl/Sample |
(2) PCRチューブにマスターミックスを20μlずつ分注する。
(3) 1.（1）で用意した検体を5μlずつ加える
(4) PCR program
Ramp Speed : 9600
Stage1 : 94℃ 5分（１サイクル）
Stage2 : 95℃ 30秒 → 60℃ 30秒 → 72℃ 1分 （35サイクル）
Stage3 : 72℃ 5分（１サイクル）
Stage4 : 4℃ （保存）
(5) 電気泳動結果例（1.5％アガロースゲルを使用）
3. 判定
内部コントロール(β-globin) (262bp)のバンドが陰性対照１(精製水)以外にあること、またEBV (265bp)のバンドが陽性対照にあることを確認後、検体の判定を行う。
陰性 : EBV (265bp)のバンドがない
陽性 : EBV (265bp)のバンドがある
)